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Cosa si vede al microscopio · Fluorescenza
Cosa si vede con un microscopio a fluorescenza
Uno strato di cellule endoteliali colorato con tre coloranti fluorescenti, come il preparato commerciale FluoCells n.º 1: DAPI nei nuclei, falloidina con Alexa Fluor 488 nell'actina e MitoTracker Red CMXRos nei mitocondri. Ogni colorante assorbe un colore di luce e ne emette un altro, di lunghezza d'onda maggiore.
Cambia filtro nel pannello: UV, blu o verde.
100×: lo strato di cellule
Le cellule endoteliali formano uno strato di cellule piatte, una accanto all'altra, come un selciato. Con il filtro blu si vede il loro scheletro di actina.
400×: un filtro, un colorante
Con luce UV di 365 nm brillano in blu i nuclei (DAPI). Con luce blu di 485 nm, in verde, l'actina (falloidina). Con luce verde di 525 nm, in rosso, i mitocondri (MitoTracker). Il filtro di emissione lascia passare la luce emessa dal colorante e blocca quella che lo illumina.
1000×: filamenti e mitocondri
Con l'obiettivo a immersione si distinguono i filamenti di actina e i mitocondri uno per uno. Se si lascia la luce accesa, la fluorescenza si va spegnendo: è il fotosbiancamento.
Una cellula, da vicino
Il nucleo, lo scheletro di actina e i mitocondri, ciascuno con il suo colorante. Al microscopio si vedono separatamente, uno con ogni filtro.
Vista in 3D: al microscopio si vede piatta, dall'alto.
Quale microscopio a fluorescenza ti serve?
Servono una sorgente di luce di eccitazione e un set di filtri per ogni colorante. Quelli che dichiarano la fluorescenza nella scheda hanno LED UV, blu e verde con i relativi filtri.
Quale microscopio mi serve?Domande frequenti
Come funziona un microscopio a fluorescenza?
Illumina il campione con luce di un colore che eccita il colorante; il colorante emette luce di un altro colore, di lunghezza d'onda maggiore, e un filtro lascia passare solo quella luce verso l'oculare.
Cosa colora il DAPI?
Il DNA: per questo marca i nuclei. Con eccitazione UV emette nel blu.
Perché la fluorescenza si spegne?
Per il fotosbiancamento: la luce di eccitazione degrada a poco a poco il colorante. Per questo conviene illuminare solo il necessario.
Come è fatta questa simulazione
Non è una fotografia: è un modello calcolato. Ingrandimenti, campo e risoluzione provengono dalla scheda tecnica di ogni microscopio; le misure del campione, dalle fonti citate qui sotto.
| Cosa | Come si calcola | Cosa c'è di approssimato |
|---|---|---|
| Ingrandimento e campo | Ingrandimento = oculare × obiettivo. Campo = numero di campo dell'oculare ÷ ingrandimento dell'obiettivo. | Esatto secondo la scheda. |
| Coloranti e spettri | DAPI 358/461 nm, falloidina Alexa Fluor 488 505/512 nm, MitoTracker Red CMXRos 579/599 nm (eccitazione/emissione, scheda di Thermo Fisher). | Colori a schermo approssimativi. |
| Filtri | Quelli della scheda dell'Achios-X AX.3152-PLi: EX 330-385/EM 420 LP, EX 460-495/EM 510 LP e EX 510-550/EM 575 LP. Ogni filtro accende un solo colorante. | Che con un filtro non si veda nulla degli altri coloranti non è verificato: i filtri di emissione sono passa-alto. |
| Misure | Cellula di circa 600 µm² e nucleo di circa 140 µm² (cellule endoteliali di aorta). | Per le cellule BPAE non esiste una misura pubblicata; la forma delle fibre e dei mitocondri è scelta. Fibre e mitocondri disegnati più spessi perché si vedano sullo schermo. |
| Fotosbiancamento | La fluorescenza si va spegnendo mentre la luce è accesa. | Il ritmo è scelto. |
Fonti
- Schede tecniche dei microscopi di Letscopes (Achios-X AX.3152-PLi).
- Coloranti e spettri: FluoCells Prepared Microscope Slides (Thermo Fisher).
- Misure delle cellule endoteliali: PMC6117589. Forma a strato: AcceGen (BPAEC).
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